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科研成果
辰山中心“一种适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因及其应用”获授权发明专利

 

所谓的内标准基因,是某种植物中具有种间特异性、种内非特异性、低拷贝数特征的一类基因。种间特异性指的是选定的基因对于此物种是特异的,而在其他物种中具有很低的同源性;种内非特异性指的是内标准基因在同一物种的不同栽培种中具有很高的同源性和相似性。例如,在植物转基因产品的定量检测中,内标准基因常被用来作为定量检测的内对照,要求内标准基因在不同栽培种中具有种内特异性的特点。在对转基因产品进行定量检测中,由于定量检测的外源基因一般是低拷贝的,因此要求内标准基因具有低拷贝数的特点,一般内标准基因为13个拷贝,最理想的情况是1个拷贝。

转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性。因此,转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数,以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用。传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern杂交法,但该方法工作量大,需要的DNA材料较多,费时费力,并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品。近年来,利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。该方法根据Ctcycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理,制作标准曲线,获得Ct值与起始模板数的相关性方程,将样品的Ct值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数,通过与内标准基因起始模板数的比较,就可知道基因组中该外源基因拷贝数。

二穗短柄草是一种冷季型温带禾本科植物,在一些地方也常常作为一种牧草,该种植物由于具备株型矮小、自花授粉、种子不散落,生命周期短、生长条件简单等特点,近年来被作为一种新型的禾本科模式植物,因此转基因二穗短柄草技术也迅速发展。由于外源基因的拷贝数对外源基因的稳定表达影响较大,因此当拿到一个转基因植株时首先要对它的外源基因拷贝数进行分析,传统的拷贝数分析是利用Southern检测技术,该种方法费时费力,而且成本较高,如果要对大量的材料进行分析,工作量比较大。因此近年出现了利用定量PCR法对转基因植物基因外源基因拷贝数分析,该种技术可以弥补Southern检测技术的不足,尤其适合对大量材料进行高通量检测。除此之外二穗短柄草也可以作为一种牧草,因此转基因二穗短柄草也可能被加工成饲料,在对饲料进行转基因检测的时候也需要该种植物的内标准基因。但是目前国际上尚未有适合二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因的报道。因此,筛选适合二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因对促进二穗短柄草转基因研究意义十分重大。

此项发明通过生物信息学分析和分子生物学实验验证,在二穗短柄草中寻找到了作为转基因二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因-BDFIM基因,该BDFIM基因具有种内一致性、种间特异性、低拷贝数的特点,符合内标准基因的标准要求,适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因。

(供稿:植物抗逆与分子进化研究组 (草种种质资源创新研究组)